01

实验背景

肺部感染是世界范围内死亡和发病的一个主要原因。混合型肺部感染的风险很高，特别是免疫功能低下的患者。混合型肺部感染患者可能有不同的抗生素谱，临床表现相较于单一细菌性肺部感染的患者更为严重。然而，由于目前常规检测方法在病原体检测灵敏度等方面的局限性，就需要快速灵敏的病原检测方法。由此催生了第二代测序(NGS)技术，NGS技术也被称为高通量或大规模并行测序，是一种允许数千到数十亿个DNA片段同时独立测序的技术。宏基因组新一代测序(mNGS)是一种非常有前途的病原体检测技术。然而，关于mNGS在混合性肺部感染中的应用报道却不多。

为了比较mNGS技术和传统检测方法的优劣性，作者选择了自年7月至年3月，共纳入的55例病例进行回顾性分析。根据临床诊断分为混合性肺部感染36例(65.5%)和非混合性肺部感染19例(34.5%)。比较mNGS与常规试验在混合肺部感染诊断及病原鉴定方面的性能。

02

实验方法：

样本来自于医院疑似肺部感染患者的肺活检和支气管肺泡灌洗液(BALF)。提取样本中的核酸建库，用BWA的方法分析，去除人类基因组序列。为了保证分析的质量，提高分析的可行性，删除了一些短的reads序列。感染病原菌的判断标准：1，细菌培养/组织病理学检测是阳性。2：同一种细菌至少出现50中不同的reads序列。3：至少含有一个结核分枝杆菌的reads片段。

03

实验结果：

在55例样本中，和传统的检测方法相比，mNGS具有更高的灵敏度，但是特异性却不如传统的培养方法。

表1mNGS和常规检测的结果对比

如表1所示，mNGS诊断混合肺部感染的敏感性明显高于常规检测(97.2%vs13.9%;P0.01)，但是其特异性却低于常规检测(63.2%vs94.7%;P=0.07)。mNGS阳性预测值为83.3%(95%CI,68.1~92.5%)，阴性预测值为92.3%(95%CI,62.1~99.6%)。常规检测和mNGS检测结果均为混合性肺部感染5例(9.1%)，但两种方法检测结果一致的只有1例(1.8%)。综上所述，mNGS检出病原菌与常规检出病原菌一致3例(5.5%)，仅1例(1.8%)为混合肺部感染（图一）。根据我们的数据，mNGS比常规检测具有更广泛的病原体检测范围。特别是mNGS的应用提高了肺部真菌感染的诊断水平。55例病例中，mNGS检出鉴定真菌31例(56.4%)，其中常规检测同种真菌阳性10例(18.2%)。mNGS检出的最常见病原体是人巨细胞病毒，在19例混合肺部感染中有检出，占34.5%。混合感染组中检出人巨细胞病毒和耶氏肺孢子虫共同感染有7例，占12.7%。

mNGS是一种很有前途的检测混合肺部感染共病原体的技术，在检测速度和灵敏度方面都有潜在的优势。mNGS不仅可以检测出普通的检测方法可以鉴定到的病原菌，还可以检测罕见的病原菌和某些常规不能培养的病毒，具有非常高的灵敏性。

图一mNGS和常规检测混合型肺部感染

mNGS和常规方法诊断混合型肺部感染。在21例混合型样本中，mNGS除了曲霉外，还检测到了病毒。在所有样本中的6例，mNGS和常规检测方法的结果不一样，有一例常规培养出了真菌和新隐球菌，但是mNGS没有检测到，但是mNGS检测到了肺炎克雷伯等常规方法没有检测到的菌种。即便有mNGS没有检测到的病原菌，但是因为mNGS不需要培养，可以同时鉴定出罕见的病原菌和病毒，大大简化了常规检测的流程，所以mNGS在检测混合型肺部感染中具有很好的辅助作用。另外在某些常规检测认为是阴性的样本中，mNGS也鉴定出了病原菌，极大的提高了临床应用中病原鉴定的灵敏度。

04

理论上，只要有足够的reads序列和足够深的测序深度，尽量将所有的reads序列在后续拼接中都用到，当然这会很大的增加工作量，是可以将所有的物种都可以鉴定出来的。另外在临床患者中经常有早期药物的治疗，并且在培养过程中，由于样本需要进行预处理，极有可能影响后续的培养过程，造成假阴性结果的出现，从而影响医生的判断，mNGS就可以很好的克服这些问题，为临床疾病的检测提供一个更加可靠的新思路。