孢子萌发作为抗真菌治疗的目标

期刊名称：AntimicrobialAgentsandChemotherapy

分区及影响因子：IF=4.Q1

通讯作者：ChristinaM.Hull

发表时间：年11月21日

机构：美国威斯康星大学麦迪逊分校医学和公共卫生学院生物分子化学系

美国威斯康星大学麦迪逊分校医学和公共卫生学院医学微生物学和免疫学系

01摘要

孢子是包括大多数真菌在内的许多生物长期生存所必需的。对于大多数致命的人类真菌病原体来说，孢子萌发是启动营养生长并最终致病的关键过程。因为发芽是致病所必需的，这一过程可以为新的抗真菌药物的开发提供真菌特异性靶点。抑制发芽的化合物可以被开发成高效、低毒的药物，用于预防和/或治疗真菌孢子介导的疾病。为了鉴定具有抑制病原真菌孢子萌发能力的药物，我们开发了一种新的基于荧光素酶的萌发试验，使用引起脑膜炎的酵母隐球菌的孢子。我们对美国食品和药物管理局(FDA)批准的LSelleck图书馆进行了筛选，确定了27种抑制发芽的药物。在这些药物中，22个同时抑制发芽和酵母菌生长，21个以前没有被指示用于治疗真菌疾病。我们详细定量了10种特异性发芽/生长抑制剂的抑制表型，并在我们的小鼠鼻腔隐球菌感染模型中测试了一种药物，即抗寄生虫化合物戊脘脒我们发现，无论是预防(感染前)还是治疗(感染后)，戊脘脒能有效地减轻肺部真菌负担。由于其在体内的有效性和低鼻腔毒性，戊脘脒一种主要的再利用候选药物，可作为一种更广泛的抗发芽剂用于预防免疫低下患者的孢子介导性疾病。戊脘脒不仅为预防真菌孢子提供了机会，也为抗真菌药物开发提供了针对病原孢子萌发的概念证明。

02简介

真菌疾病影响超过10亿人，每年导致约万人死亡。目前，有三种主要的抗真菌药物用于治疗侵袭性真菌疾病，并且它们都受到限制。人类急性药物毒性、真菌耐药性的出现和疗效不足导致对抗真菌感染的武器相对薄弱。需要开发新的抗真菌药物；然而，由于真菌和人类共有的真核性质，抑制真菌的化合物通常对人类也是有毒的，这是抗真菌药物开发的主要障碍之一。过去，将药物毒性降至最低的常见策略是抑制两种已知的真菌特异性途径:真菌细胞壁合成或麦角固醇代谢。这种有限的靶标数量在一定程度上导致了抗真菌药物的数量有限。为了扩大新抗真菌药物的潜在靶标数量，另一种策略可能是更广泛地抑制真菌特异性发育过程。

真菌孢子萌发是针对抗真菌发展的一个过程。孢子是一种休眠的、抗压力的细胞类型，已知在植物和动物真菌病原体中都能引起疾病。孢子不能繁殖，必须分化(萌发)才能营养生长。由于孢子介导的病害是由大量真菌生长引起的，所以孢子萌发是孢子介导的病害的一个重要过程。与其他真菌过程相比，人们对孢子萌发知之甚少，特别是在人类真菌病原体中；然而，它似乎与人类发生的过程不同，这表明孢子萌发涉及真菌特有的细胞途径。由于真菌的特异性和在孢子介导的疾病中的重要性，我们推测真菌孢子萌发及其涉及的分子过程是开发新型抗真菌药物的理想靶点。

由于新药开发的时间线可能长达数十年，而且对新的抗真菌药物的需求非常迫切，因此我们优先对美国食品和药物管理局(FDA)批准的现有药物进行再利用评估。这些药物已经通过了人体毒性测试，使它们比其他潜在的治疗方法更快地到达有需要的患者手中。在这项研究中，我们使用高通量试验来筛选FDA批准的非专利药物的文库，以识别那些抑制人类真菌病原体新生隐球菌的药物。隐球菌是引起真菌性脑膜炎的最常见原因，已被建立为人类真菌病原体的研究模型。这种环境中的担子菌酵母经历有性发育(包括同性和异性)以形成担孢子。酵母和孢子都被认为是人类疾病中的感染性粒子。在萌发过程中，孢子从小的卵形颗粒转变为大的圆形酵母，然后通过发芽进行克隆生长。以隐球菌孢子萌发为新的筛选靶点，我们发现并表征了FDA批准的10种现有的抑制萌发的药物。

作为这些新发现的抗菌药物之一，芳香族二胺类化合物戊脘脒于具有很高的抗真菌再利用/扩大用途的潜力而被选择用于体内表征。由于病原真菌孢子的感染途径一般是通过吸入，因此使用雾化戊脘脒防致死性真菌疾病可能是一种有效的策略。为了确定戊脘脒体内预防真菌孢子介导性疾病的能力，我们在一种孢子源性隐球菌病的小鼠模型上评价了它的抗真菌和抗萌发活性。我们发现戊脘脒对小鼠的耐受性很好，表现出抗真菌和抗萌发活性，从而显著降低了隐球菌的肺负荷。综上所述，我们的数据支持这一假设，即孢子萌发是抗真菌药物开发的可行靶点，现有药物可能在预防和治疗侵袭性真菌疾病方面发挥作用。

03结果

01

对酵母生长和孢子萌发抑制剂的高通量筛选确定了10种可再利用的候选药物

为了确定隐球菌孢子萌发和酵母生长的抑制剂，我们筛选了LSelleckFDA批准的药物文库，其中包含种化合物的阵列(从SelleckChemical购买)。了解到孢子在萌发成酵母后对细胞裂解变得更加敏感，我们创造了一个报告菌株，其中一种已知存在于孢子中的蛋白质(Isp4)与荧光素酶基因NanoLuc(PromegaCorporation)融合在一起。含有该构建体的孢子对裂解不是很敏感，并且在NanoLuc检测中产生低水平的纳米纤维素酶(NL)信号。当它们萌发成酵母时，它们对裂解变得更加敏感，从而产生更高的纳米纤维素酶信号。在30°C(完全萌发到酵母中)培养10h后，荧光素酶水平增加了约20倍，并保持在较高水平。因此，荧光素酶活性与孢子萌发状态有直接关系，因此可以用荧光素酶活性作为孢子萌发进程的标志。这个屏幕与nm的光密度(OD)读数结合在一起，以监测化合物能抑制酵母生长的能力。

为了这项研究的目的，我们将已知的抗真菌药物定义为FDA批准用于治疗真菌感染的任何药物。我们预测，我们的生长分析将识别出文库中绝大多数已知的抗真菌药物，事实就是如此。使用定义为非药物对照OD的75%的OD信号的生长抑制截止值，我们检测到24种已知抗真菌药物中的23种(表1)。氟胞嘧啶是个例外，它是指定的抗真菌药物中效果最差的药物之一。筛查未检出可能是由于氟胞嘧啶浓度(1.3μg/ml)低于抑制JEC20/21菌株本底所需的最低抑菌浓度(MIC)所致。使用发芽抑制截止值(荧光素酶信号为非药物控制信号的30%)，我们在24种抗真菌药物中鉴定出6种发芽抑制剂(如表1所示)。

使用相同的纳米纤维素酶信号(对照的30%)和OD(对照的75%)的截止值，我们在文库中的药物中鉴定出另外60种酵母菌生长抑制剂，其中16种也能抑制发芽(表2)。五种药物只抑制萌发(而不是营养生长)。因为抑制一群孢子不太可能是%有效的，所以我们优先选择既能抑制萌发又能抑制生长的药物，这样就能防止任何逃脱萌发抑制的孢子在营养状态下生长。

总的来说，通过美国食品和药物管理局批准的药物筛选，我们确定了22种具有发芽抑制和生长抑制能力的药物。根据目前使用的指定类别和剂量-反应曲线，我们选择了10种抑制剂(3种已知抗真菌药物和7种附加药物)进行进一步分析(表3)。所有10种药物均产生纳米荧光素酶信号衍生的浓度响应，最符合单调的sigmoid曲线，与标准药物剂量-响应模型一致(参见补充材料中的图S1)。在所有情况下，数据与发芽抑制(由荧光素酶信号确定)和药物暴露增加之间的因果关系一致。

02

十种再利用候选药物抗真菌活性的验证和定量

为了验证前10名候选药物的高通量筛选结果，我们在独立的生长试验中确定了每种药物的最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MFC)(表4)。我们测试了它们与人类致命性真菌疾病的三种最常见原因(新生隐球菌、烟曲霉和白色念珠菌)的对比，这三种真菌代表了系统发育和生物多样性的真菌病原体。采用临床实验室标准研究所(CLSI)和EUCAST方法，确定已知的3种抗真菌药物中的2种(戊脘脒联苯苄唑)对两种常见的隐球菌MIC≤6.25g/ml有较高的杀菌活性，但对念珠菌和曲霉的杀菌活性较差。而已知的第三种抗真菌药物益康唑对所有受试真菌均有良好的抑制生长和杀灭作用，MIC和MFC分别≤6.25和≤12.5g/ml。这些发现与以前发表的关于这些药物的抗真菌特性的数据基本一致，除了戊脘脒，它产生的抗隐球菌的MFC比之前报道的要低得多。

筛选出的7种新药包括用于抗菌漱口水的各种药物(十六烷基吡啶、阿列西定和苯乙胺)，治疗肠易激综合征(IBS)和绦虫感染的药物(分别为奥替溴铵和氯硝柳胺)，mTOR途径抑制剂(替西罗莫司)，以及乙醛脱氢酶抑制剂(双磺拉姆)。我们测定了它们的最低抑菌浓度(MIC)和最低抑菌浓度(MFC)，发现它们对隐球菌均表现出良好的抑菌活性，MIC≤6.25ug/ml，具有主要的杀菌活性。除氯硝柳胺外，其余药物对念珠菌均有较好的抗菌活性，除氯硝柳胺、替西罗莫司和双硫仑外，其余药物对曲霉均有较强的抗菌活性。这些数据证实了隐球菌生长抑制的初步筛选结果，并证实或确立了这些药物对念珠菌和曲霉的抗真菌活性。

03

10种再利用候选药物抗菌活性的验证和定量

为了量化这10种药物抑制隐球菌孢子萌发的效果，我们使用了一种基于高分辨率微流体的萌发试验。在这项检测中，每种条件下大约10,个纯化的孢子被装载到一个有营养物质存在的微型设备中，并在显微镜下监测大小和形状的变化。这个过程在30°C下监测超过16h，可以用来定量不同时间点的孢子和酵母的比例，并监测萌发过程(图1A)。我们在没有药物或25ug/ml戊脘脒联苯苄唑或益康唑存在的情况下进行了这项测试，并在0和16小时评估了细胞数量。我们观察到，在没有添加药物的情况下孵育的对照孢子群体完全从孢子转变为酵母，而在三种已知抗真菌药物中的任何一种存在下孵育的孢子都没有转变为酵母，仍然保持小而卵形(图1B，上图)。对每个病例中细胞群体的量化证实，非药物对照细胞从几乎所有孢子的群体转变为几乎所有酵母的群体。相反，在药物存在的情况下，孢子几乎完全保留了孢子，在戊脘脒和联苯苄唑的情况下，只有一小部分(5%)转变为酵母，在益康唑存在的情况下没有检测到的转变(图1B，底板)。这些数据验证了纳米纤维素酶萌发试验的结果，也证实了三种先前已知的真菌生长抑制剂是真正的孢子萌发抑制剂。

筛选出的7种剩余药物中的5种也在微流控装置中进行了测试，以确定它们的发芽抑制表型。像以前一样，每个条件下大约10,个孢子在有营养的情况下被装载到微型设备中，并用不用药或用25ug/ml的阿列西定、奥替溴铵、氯硝柳胺、替西莫司或双硫兰处理。设备在30°C下孵育，并在0、4、8、12和16小时进行显微镜评估。与我们的高通量筛选结果一致，我们观察到所有在本实验中测试的药物都不同程度地抑制孢子萌发(图2A)。盐酸阿列克定、奥替溴铵和氯硝柳胺均能完全抑制孢子萌发，孢子形态在0-16h之间没有变化(图2A，第2-4栏)。相反，这个浓度的泰西罗莫斯似乎只会从整体上减缓种子的萌发过程。当孢子暴露于泰西罗莫斯时，它们开始并保持萌发，但速度较慢，导致从卵形到圆形的转变和大小的增长都延迟了(图2A，第5栏)。这一观察结果得到了堆积条形图(图2A，第5栏，底部)所示定量的支持。在泰西罗莫司中，16h的细胞数量与非药物对照8h的细胞数量非常相似，表明萌发有~8h的滞后。最后，双硫胺在此浓度下对种子萌发的抑制作用较弱，导致整个芽期滞后约2小时。在较高浓度的双硫兰(40μg/ml)下，孢子似乎在~8h停止生长，不能增加大小，但在20h后恢复(图2)。S2)。

剩余的两种药物，西吡氯铵和苄索氯铵，由于它们的粘度，不能在微流体装置中进行测试，因此在改进的大体积试验中进行测试，并且仅在0和16小时成像。两种药物都能够完全抑制孢子萌发(图2B)。综上所述，这些分析证实，我们确定了七种FDA批准的通常不用作抗真菌药物的药物，这些药物能够抑制真菌孢子萌发，从而有可能将这些药物重新用于预防致命的真菌疾病。

04

抗菌药物戊脘脒会均匀地减慢孢子的发芽速度，然后停止萌发。

产生孢子的人类真菌病原体通常通过吸入感染宿主，使肺部成为预防感染孢子的最佳目标。在10种同时具有抗生长和抗终止活性的药物中，戊脘脒人肺中的应用最为突出。戊脘脒一种抗寄生虫药物，目前被批准用于预防和治疗一种单一的真菌病原体，耶氏肺囊虫，它在免疫功能低下的患者中引起肺囊虫肺炎(最初被认为是一种原生动物寄生虫)。戊脘脒存在于雾化制剂中，随着时间的推移，导致药物在肺部积聚，毒性有限。其对隐球菌生长和萌发的功效使其成为进一步测试和表征真菌抗终止剂的理想候选物。

为了确定戊脘脒发芽抑制中的完整表型，我们在基于微流体的发芽试验中评估了戊脘脒硫酸酯的各种浓度。在这个实验中，每种条件下约10，个孢子在营养物的存在下被装载到微型装置中，并用0、3.13、6.25、12.5、25或50微克/毫升的戊脘脒理。装置在30℃孵育，并在0、4、8、12和16小时进行显微镜评估。正如我们最初分析所预期的(图1)，戊脘脒25微克/毫升时完全抑制发芽(图3)。戊脘脒以浓度依赖的方式抑制发芽。在3.13微克/毫升时出现轻微抑制，导致发芽过程延迟约2小时(图3，第2栏)。随着浓度增加到6.25ug/ml时，发芽速度均匀减慢，导致延迟6小时，在12.5微克/毫升时，孢子萌发几乎被完全抑制，在16小时内观察到整个种群的圆形度非常缓慢地增加(图3，第3和4栏)。在所有图中存在单个孢子群表明戊脘脒对孢子的抑制是一致的。也就是说，没有对喷他脒具有抗性并且能够逃避抑制的孢子亚群。

为了表征戊脘脒死隐球菌孢子萌发群体的能力，我们根据完全杀菌活性(杀死%的细胞)确定了其最小杀菌浓度(MGC)。戊脘脒显示出杀菌活性，MGC值为50微克/毫升。根据这些数据，我们得出结论，喷他脒是一种杀菌药物，在体外抑制隐球菌孢子萌发方面是一致有效的。

05

戊脘脒在体内抑制酵母生长和孢子萌发

因为戊脘脒体外是酵母生长和萌发的强抑制剂，我们假设它在体内会抑制生长和萌发。为了确定戊脘脒体内的抗真菌活性，我们使用隐球菌病的小鼠吸入模型感染小鼠，用戊脘脒疗它们，并评估真菌负荷。每组五只小鼠鼻内感染5×酵母或2×孢子。在感染后24小时，小鼠通过鼻内滴注4毫克/千克/天的戊脘脒乙磺酸盐或磷酸盐缓冲盐水连续治疗三天。感染后24小时，孢子已萌发成酵母，酵母是肺中已建立的细胞类型。在感染后第4天，从所有小鼠收集肺，并测定每克组织的真菌负荷(图4A)。在酵母感染的(图4B)和孢子感染的(图4C)小鼠中，戊脘脒理的小鼠在肺中的真菌负荷明显低于PBS处理的小鼠。感染后24小时开始的治疗减少了真菌负荷，表明在已确定的感染中，戊脘脒是体内酵母生长的有效抑制剂。

为了确定戊脘脒否能抑制体内发芽，我们用孢子进行了改良感染。在该实验中，小鼠首先用戊脘脒理，然后用隐球菌孢子感染(图5A)。每组5只小鼠用4毫克/千克/天喷他脒或仅用PBS鼻内治疗3天。第4天，所有小鼠都感染了2×个孢子。总共8天后(感染后4天)，处死所有小鼠，并测定肺部真菌负荷。我们发现在感染前用戊脘脒防性治疗3天的小鼠的真菌负荷比未治疗的小鼠低2倍(图5B)。这表明在感染前给予戊脘脒可以最大限度地减少小鼠孢子介导感染的肺部真菌负荷

这些数据与在感染开始前给药时体内戊脘脒发芽的抑制一致。然而，我们不能排除肺部真菌负荷的减少是由于孢子萌发后戊脘脒酵母生长的抑制。为了评估戊脘脒体内孢子萌发的直接影响，我们用携带绿色荧光蛋白(GFP)标记物的孢子感染小鼠，在孢子感染后8小时从预防性治疗的小鼠的肺中回收支气管肺泡灌洗液，用细胞壁染料(calcofluorwhite)对样品进行染色，并在显微镜下评估真菌负荷的性质。选择8小时收获是因为它在感染后足够长以确保孢子至少已经开始萌发过程，但又足够早以确保任何存在的酵母不是营养生长的结果。我们发现，来自戊脘脒理的小鼠的细胞在大小和形状上明显比来自未处理小鼠的细胞与孢子更一致，未处理小鼠的细胞与酵母的细胞更一致(图5C)。我们对来自肺液的真菌细胞的大小和形状进行了定量，并在戊脘脒处理的小鼠中检测到大约两倍于未处理小鼠的孢子和4倍于未处理小鼠的酵母(图5D)，表明喷他脒的存在对发芽有抑制作用。

这些数据表明，感染前用戊脘脒理导致肺部环境中孢子萌发受到抑制，最终导致较低的真菌负荷。综上所述，这些数据表明预防性使用的戊脘脒有体内抗隐球菌孢子萌发的活性，支持进一步研究戊脘脒在预防脆弱患者孢子介导的真菌疾病中的潜在用途的论点。

04讨论

鉴于对低毒性、高效抗真菌药物的迫切需求，该领域必须考虑新的方法来靶向人类真菌病原体并避开它们的宿主。在这里，我们测试了真菌孢子萌发过程可以作为药物介导的抑制分化为植物生长细胞的目标，最终防止侵袭性真菌疾病的假设。先前在其它系统中对真菌孢子萌发的研究表明，萌发仅仅是一个经过修饰的细胞周期，其中孢子在类似于从任何静止状态(例如，稳定生长阶段)恢复的过程中脱离休眠。然而，最近来自隐球菌的证据表明，至少一些发生在发芽过程中的事件是特定的。在以前的研究中，我们鉴定和表征了富含孢子的蛋白质，其中一种蛋白质(Isp2)似乎在正常营养生长中起着发芽特异性作用，但没有明显作用。这些Isp2数据和其他未发表的观察表明，发芽具有不同于标准细胞周期的特性，表明发芽的至少一些方面涉及发芽特异性蛋白质。萌发过程对真菌的明显特异性，以及萌发特异性蛋白质和事件的发现，使得萌发成为真菌特异性抑制和药物开发的有希望的目标。

目前，还没有批准的预防隐球菌感染的药物。唑类药物的初级预防已被证明可降低晚期艾滋病毒成人隐球菌疾病的发病率；然而，没有证据表明总体死亡率下降。这些发现，加上其他障碍，如成本和抗真菌药物耐药性发展的风险，导致唑类不被推荐用于侵袭性真菌病原体的常规初级预防。除了提供真菌特异性药物靶标，发芽为预防真菌疾病提供了独特的机会。孢子是抗压力的细胞类型，是许多真菌病原体的已知感染颗粒，在隐球菌中，与酵母相比，孢子在哺乳动物宿主中显示出不同的疾病特征。针对所有潜在感染细胞类型的抗真菌药物可用于通过预防来对抗真菌病原体。这种药物需要是低毒性和杀真菌的，以减轻耐药性的发展。可以对免疫功能低下的个体进行预防性治疗，为真菌疾病的预防提供了一个急需的选择。

美国食品和药物管理局批准的非专利药物的筛选为筛选通常具有已知分子靶点的分子提供了独特的机会。使用这种方法，我们可以确定真菌孢子萌发的重要途径，以帮助理解这一关键的分化过程。这项研究中潜在工具的一个最明显的例子是药物亚历克西丁，它具有很强的抗真菌活性，是孢子萌发的有效抑制剂。此前已有报道称该药物可抑制隐球菌的几种磷脂酶。这表明磷脂酶对真菌孢子的萌发很重要；然而，亚历克西丁在发芽期间的直接目标仍有待确定。在未来，我们可以使用亚历克西丁(具有已知或可疑的靶标)等药物作为工具来探测发芽过程中的特定分子事件。

另一方面，发现药物的抗真菌特性有助于阐明其作用机制。例如，我们在本研究中描述的一种具有未知抗真菌活性的药物是奥替溴铵(OB)。OB是一种季铵化合物，由于其抑制胃肠动力的能力，目前被批准用于治疗肠易激综合征。最近，OB被确定具有抗菌活性，在这项研究中，我们证明了OB对多种真菌病原体的强抗真菌活性。这些发现表明口服避孕药在肠易激综合征中的部分疗效可能归因于其抗菌和/或抗真菌活性。事实上，最近的一项研究表明肠道真菌是肠易激综合征患者发病的原因。随着我们对肠道微生物和真菌生物群在人类健康中的作用的理解的提高，确定OB的抗菌活性在治疗肠易激综合征中的作用可能是非常有用的。

筛选FDA批准的药物还有一个好处，即提供比新化合物更快到达有需要的患者手中的药物。在这项研究中，我们发现抗寄生虫药物戊脘脒示出作为发芽抑制剂的特殊前景，原因有很多。首先，戊脘脒被批准用于对抗一种单一的真菌，肺囊虫(以前被归类为原生动物寄生虫)，这种真菌会导致肺炎，主要是在艾滋病患者中。其次，戊脘脒批准用于免疫功能低下的个体，这是受隐球菌病影响的主要群体。第三，戊脘脒已经存在于雾化制剂中，允许无创给药。第四，众所周知，这种药物会在肺部积聚，而肺部是隐球菌感染的主要部位。最后，这种药物已经被批准用于预防，这将有助于在高危患者中使用。

我们的发现表明，戊脘脒有效降低隐球菌感染小鼠模型中的真菌负荷，并能抑制体内孢子萌发，这表明戊脘脒在肺中积累并保持足够长的时间，以发挥其抗真菌和抗终止作用。因为静脉注射喷他脒对人体毒性很大，所以它通常不是预防人体内肺孢子虫病的首选药物。然而，当戊脘脒为气雾剂在肺部给药时，毒性问题较少。我们的研究表明，戊脘脒可以用作预防药物，保护患者免受隐球菌感染，因此值得进一步的临床研究。最后，这些数据表明真菌孢子萌发可能是开发新的抗真菌策略的有效目标。

在这项研究中，我们通过鉴定和表征FDA批准的具有抗终止活性的药物，证明孢子萌发是抗真菌药物开发的一个可行目标。这些发芽抑制剂有潜力被用于新的抗真菌治疗。特别是，可以在高危患者中预防性使用强有力的低毒性抗终止剂，以防止暴发性孢子介导疾病的发展。为了支持这一想法的可行性，我们确定我们鉴定的药物之一，戊脘脒，通过抑制发芽和随后的酵母生长，有效地降低了体内的真菌负荷。喷他脒被有效地用作小鼠隐球菌感染的预防性治疗，并作为美国食品和药物管理局批准的药物在孢子介导的真菌疾病预防中潜在用途的范例。