目的比较交叉引物扩增(CPA)、恒温核酸扩增荧光检测(RealAmp)法与利福平耐药实时荧光定量核酸扩增(XpertMTB／RIF)法对肺结核诊断的效果，评估CPA和RealAmp医院推广的价值。方法收集年10月至年lO月河南省中牟县疾病预防控制中心、新密市和邓卅l市结核病防治所疑诊肺结核患者例，其中男例，女例，年龄15～86岁，平均55岁。按照中华医学会结核病学分会制定的“肺结核诊断和治疗指南”标准诊断，确诊肺结核患者例，非结核病患者例。收集3份痰标本，优先选用晨痰，当无晨痰时可选择夜间痰。对份痰标本涂片染色镜检，行抗酸染色及固体罗氏培养基培养，同时行CPA、RealAmp和XpertMTB／RIF法检测。对培养阳性的菌株进行MPB64抗体测定及初步菌种鉴定。以菌种鉴定后的培养结果和临床诊断结果为对照，比较CPA、RealAmp和XpertMTB／RIF检测MTB的敏感度和特异度。结果与固体培养结果比较，CPA、RealAmp和XpertMTB／RIF法检测的敏感度分别为85．5％(／例)、85．5％(／例)和87．9％(／例)，三者比较差异无统计学意义(x2=1．6，P0．05)；CPA、RealAmp和XpertMTB／RIF法的特异度分别为96．8％(／例)、93．2％(／例)和95．3％(／例)，三者比较差异有统计学意义(x2=37．8，P0．)。与临床诊断结果对比，涂片镜检、固体培养、CPA、RealAmp和XpertMTB／RIF检测MTB的敏感度分别为21．7％(／例)、34．9％(／例)、34．6％(／例)、39．2％(／例)和38．1％(／例)，3种分子检测法的敏感度高于涂片镜检(x2=31．9，P0．01)，但3种方法问的敏感度比较差异无统计学意义(X2=2．9，P0．05)。与临床诊断结果比较，涂片镜检、固体培养、CPA、RealAmp和XpenMTB／RIF法的特异度分别为％(／例)、％(／例)、98．8％(／18lo例)、98．8％(／例)和97．0％(／例)，3种分子检测方法间的特异度比较差异无统计学意义(X2=0．16，P0．05)。结论CPA、RealAmp与XpertMTB／RIF检测痰标本的敏感度和特异度相似，但CPA与RealAmp检测快速、简便，更适于基层实验室对肺结核的诊断。

结核，肺；核酸扩增技术

基金项目：国家科技重大专项(ZXl0--)

我国是全球30个结核病高负担国家之一，位居全球第3位，每年新发结核病患者约90万例。1o。目前我国基层结核病实验室常用的涂片显微镜检查敏感度较低，固体培养敏感度高但所需时间长(3～8周)。全国结核病“十三五”防治规划中明确提出肺结核患者病原学阳性的诊断率达到50％以上，尽快提升结核病实验室的检测能力，特别是基层实验室的能力是亟需解决的问题之一。随着分子生物学技术的发展，近年来涌现出许多快速诊断结核病的方法，其中利福平耐药实时荧光定量核酸扩增(XpertMTB／RIF)法是其中之一，该方法使用全自动、定量、半巢式实时荧光PCR检测系统，敏感度和特异度较高，可快速报告MTB和利福平的耐药结果。2圳，是世界卫生组织推荐用于肺结核快速诊断的分子检测方法，但因设备和试剂昂贵、维护成本高及实验室信息安全等原因，限制了在我国基层单位的广泛应用。MTB交叉引物扩增(cross—primingamplification，CPA)是一种恒温核酸扩增技术，将核酸扩增、杂交和试纸条检测3种技术有机地融为一体，在63℃扩

增反应体系中加入2对MTB特异性引物和2条特异性探针，一次性完成核酸的扩增及杂交过程，再用防污染核酸快速检测装置对MTB感染进行定性诊断，操作过程简单方便‘5。7o。环介导恒温扩增技术(p—mediatedisothermalamplification，LAMP)是Notomi等‘8o于年首先报道的恒温核酸扩增技术，可快速、高效、高特异地扩增目标靶序列。9。11I。恒温荧光检测技术(RealtimeLAMP，RealAmp)应用LAMP检测技术，在63℃恒温条件下扩增靶标核酸，通过使用荧光检测仪器观察有无s形扩增曲线来自动判读结果，操作简单方便，2h内即可获得结果。本研究比较CPA、RealAmp与XpertMTB／RIF诊断结核病的价值，评估2种恒温扩增方法在基层单位的应用前景。

对象与方法

一、对象

纳入河南省中牟县疾病预防控制中心、邓州和新密市结核病防治所3个县级单位年10月1日至年10月31日就诊的可疑初治肺结核患者，共纳入例，排除2例培养污染和25例经鉴定为感染非结核分枝杆菌患者，对剩余的例进行比较分析，其中男例，女例，年龄15～86岁，平均55岁。按照“肺结核诊断和治疗指南”¨21标准诊断，确诊肺结核病患者例，非结核病患者例。

二、仪器与试剂

XpertMTB／RIF实时荧光PCR检测仪(美国赛沛公司)，恒温荧光检测仪(Deaou一C，广州迪澳生物科技有限公司)。抗酸染色试剂(珠海贝索生物有限公司，批号：081)，酸性罗氏培养基(珠海贝索生物有限公司，批号：0517)，CPA检测试剂盒(杭州优思达生物技术有限公司，批号：1103)，RealAmp检测试剂盒(广州迪澳生物科技有限公司，批号0801)，MTB／RIF检测试剂盒(美国Cepheid公司，批号：)。

三、研究方法

1．实验室检测流程：收集3份痰标本，优先选用晨痰，当无晨痰时可选择夜间痰进行涂片染色镜检，再进行固体培养、CPA、RealAmp与XpertMTB／RIF检测，痰标本按照固体培养前处理流程进行消化处理，保证终体积14ml，酸性罗氏培养每管接种0．1ml处理液。前处理液每管分装至1～1．5ml离心管中，取3管分别完成CPA、RealAmp和XpertMTB／RIF检测。剩余前处理液一20cC冻存，以防培养污染或恒温扩增检测失败时使用。

2．涂片镜检：采用萋一尼氏染色法对痰标本直接涂片镜检，操作方法参照《中国结核病防治规划一痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》oJ3]中的标准化操作程序。

3．分离培养：简单法同体培养试验按照《分枝杆菌分离培养标准化操作程序及质量保证手册》。14o中的操作程序进行，优先选取晨痰和夜间痰，每份痰标本培养2管，共4管。

4．XpertMTB／RIF检测：取1ml痰标本消化液，加入1ml的XpertMTB／RIF消化液，振荡30S，静置15min，将2ml消化液加入XpertMTB／RIF反应试剂盒中，然后将其放入4通道XpertMTB／RIF平台中自动运行，2h后查看系统显示的结果。

5．CPA检测：用痰标本消化液提取MTB的DNA，以提取的DNA为模板，用CPA试剂盒进行核酸叵温扩增，具体操作参照试剂盒说明书。结果判读：若检测线和质控线同时出现，判为阳性；若仅出现质控线，判为阴性；若质控线和检测线均未出现，结果无效。

6．RealAmp检测：用痰标本消化液提取DNA后，用恒温荧光检测仪扩增45min，温度为63℃。结果判读：若有S形扩增曲线，则判断为阳性(含MTB)；若无S形扩增曲线，则判为阴性(不含MTB)。

7．菌种初步鉴定：对痰标本分离培养的阳性菌株进行MPB64分泌蛋白检测¨5

，按照MTB抗原检测试剂(杭)llgd新生物检控技术公司)说明书进行。

四、质量控制3个地区的结核病实验室痰检质量由河南省结核病参比实验室控制，质控结果符合《痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》要求，且痰分离培养年污染率5％，涂阳培阴率10％。

五、统计学方法

采用SPSS19．0统计软件进行统计学分析。分别以鉴定后培养结果和临床诊断结果为对照计算CPA、RealAmp和XpertMTB／RIF检测的敏感度和特异度；采用x2检验(SPSSStatistics19．0软件)对不同检测方法进行比较，以P0．05为差异有统计学意义。

结果

一、与固体培养方法比较3种方法的检测效能

固体培养结果阳性的例中，采用CPA、RealAmp和XpertMTB／RIF检测的敏感度分别为85．5％(／例)、85．5％(／例)和87．9％(／例，XpertMTB／RIF检测报错误2例)，3种检测方法的敏感度比较差异无统计学意义(x2=1．6，P0．05)。培养阴性的株中，CPA、RealAmp和XpenMTB／RIF检测的特异度分别为96．8％(／例)、93．2％(／例)和95．3％(／例)，3种检测方法的特异度比较差异有统计学意义(x2=37．8，P0．)。见表1。

涂阳培阳患者例，CPA检测阳性例(95．4％)，RealAmp检测阳性例(94．7％)，XpertMTB／RIF检测阳性例(97．1％)，三者阳性率比较差异无统计学意义(x2i---2．2，P0．05)。涂阴培阳患者例，CPA检测阳性例(71．6％)，RealAmp检测阳性例(72．6％)，xpenMTB／RIF检测阳性例(75．0％)，三者阳性率比较差异无统计学意义()(2=0．6，P0。05)。涂阳培阴患者18例，CPA检测阳性13例，RealAmp检测阳性14例，XpertMTB／RIF检测阳性13例，三者阳性率比较差异无统计学意义(X2=0．19，P0．05)。

二、3种方法对临床确诊病例的诊断效能

临床确诊的例肺结核患者中，涂片镜检、固体培养及CPA、RealAmp和XpertMTB／RIF检测的敏感度分别为21．7％(／例)、34．9％(／例)、34．6％(／例)、39．2％(／例)和38．1％(／例)。3种分子检测法的敏感度显著高于涂片镜检(x2=31．9，P0．01)，但三者间比较差异无统计学意义(x2=2．9，P0．05)。临床诊断为非结核的例中，涂片镜检、固体培养、CPA、RealAmp和xpertMTB／RIF的特异度分别为％(／例)、％(／18lO例)、98．8％(／例)、98．8％(／例)和97．0％(／例)，见表2。3种分子检测方法特异度比较差异无统计学意义(×2=0．16，P0．05)。

三、3种检测方法与固体培养结果的一致性

培养阴性、CPA检测阳性的86例中，临床确诊为肺结核的70例(81．4％)；培养阴性、RealAmp检测阳性的例中，临床确诊为肺结核的例(74．3％)；培养阴性、XpertMTB／RIF检测阳性的例中，临床确诊为肺结核的例(88．1％)。3种分子检测方法结果均为阳性的71例，临床均确诊为肺结核(％)；CPA和RealAmp检测结果均为阳性者9例，其中8例临床确诊断为肺结核；CPA和XpertMTB／RIF检测均为阳性者2例，临床均确诊为肺结核；RealAmp和XpertMTB／RIF检测均为阳性的30例中24例临床确诊为肺结核。固体培养阳性但CPA检测阴性的70例中，57例(81．4％)涂片阴性且培养菌落生长数目较少(20个)；固体培养阳性而RealAmp检测阴性的70例中，55例(78．6％)涂片阴性且培养菌落生长数目较少(20个)；固体培养阳性而XpertMTB／RIF检测阴性的58例中，50例(86．2％)涂片阴性且培养菌落生长数目较少(20个)。

讨论

目前，尽管涂片和痰培养检测MTB具有许多缺点，但涂片价格低廉且操作方便，固体培养可提供后续的药敏试验菌株并进行分子流行病学分析，故仍作为常规方法使用。核酸恒温扩增技术的出现，使得分子生物学检测技术不需要昂贵的扩增仪器也可以进行，反应所需时间可控制在1h左右，已逐渐成为基层结核病实验室对传统方法的补充，有时可替代传统方法。文献报道，以BacT／Alert3I)检测结果为金标准，CPA检测的敏感度和特异度达到92．8％(90／97)和98．8％(82／83)‘7o；而在基础实验室多中心评估中CPA检测的敏感度和特异度为84．1％和97．8％j，这与本研究结果一致(85．5％和96．8％)。欧喜超等¨刊发现，与临床诊断结果比较，RealAmp检测的敏感度为39．5％，高于涂片镜检的17．2％，与液体培养的敏感度39．7％基本相当。本研究中，与临床诊断结果比较，RealAmp检测的敏感度为39．2％，与文献报道结果一致。17。；CPA和XpertMTB／RIF检测敏感度分别为34．6％和38．1％，三者比较差异无统计学意义(x2=2．9，P0．05)。XpertMTB／RIF法因其自动化程度高、操作简便且可快速发现结核病患者和对利福平耐药物的结核病患者，因此世界卫生组织推荐用于结核病的诊断。本研究中XpertMTB／RIF检测涂阳培阳患者的阳性率为97．1％，涂阴培阳患者的阳性率为75．0％，与文献报道结果(涂阳培阳为94．1％一％，平均值为97。1％；涂阴培阳为57．1％～88．8％，平均值为69．5％)一致。1S-22]。与固体培养结果比较，CPA、RealAmp与XpertMTB／RIF检测的敏感度分别为85．5％、85．5％和87．9％，CPA和RealAmp检测的敏感度与XpertMTB／RIF比较差异无统计学意义(x2=1．6，P0．05)，这表明对于肺结核的诊断，CPA和RealAmp具有与XpertMTB／RIF相当的效能。在患病率稳定的情况下，检测的特异度越低，则阳性预测值越低，无论是与固体培养法比较还是与临床诊断比较，三者的阳性预测值均印证了这一结论。进一步对培养阴性、3种分子检测方法检测阳性的结果进行分析，发现RealAmp法的假阳性54例，XpertMTB／RIF22例，CPA21例，RealAmp检测的假阳性例数最多，可能与RealAmp结果判读标准的临界阈值设定有关，特别是检测结果处于临界值附近时，设定过低，则可能出现假阴性，过高则可能出现假阳性；也可能是RealAmp扩增效率高易发生非特异性扩增所致，还需要进一步研究ⅢJ。进行分子检测时，控制污染是最重要的，而基层实验室条件比较简陋，实验人员的技术能力相对较低，控制和处理污染的能力较弱，需要选配低污染风险的检测方法。本研究中的3个实验室均未出现污染现象。2种恒温方法在DNA提取过程中的液化、离心、洗涤等环节是在开放环境中进行，容易出现污染，随后的DNA扩增和扩增物检测及结果判读均在密闭环境中进行，降低了污染率；而XpertMTB／RIF除第1步痰标本液化外，其他步骤均在密闭体系内完成，污染率相比恒温方法大大降低。目前，一种新型的无仪器核酸快速提取装置正在开发，该装置应用注射器将经前处理的标本核酸裂解，通过抽吸将裂解的核酸附着在装置内的核酸亲和膜上，再用清洗液将膜上杂质和抑制物去除，最后用洗脱液将核酸从膜上洗脱下来，制备成扩增模板，这种装置用于恒温扩增分子检测将减少交叉污染风险的出现。总之，本研究结果显示，CPA和RealAmp法具有与XpertMTB／RIF法相当的检测能力，可简便、快速检测痰标本中的MTB，适于基层实验室对肺结核的诊断。